由于高效液相靈敏度高，對流動相溶劑的純度要求較高，不純的溶劑會引起基線不穩或產生“偽峰”。此外，溶劑的極性也要與待測樣品、檢測器匹配等等。如果溶解度欠佳，樣品會在柱頭沉淀，不但影響純化分離，且會使柱子惡化。那么，我們在HPLC溶劑選擇的時候，需要遵循哪些原則呢？

參考下表常用溶劑在不同波長下的吸收值：

1、流動相溶劑的選擇：流動相溶劑的正確選擇對于高效液相色譜分析(HPLC)的成功與否非常重要。目前還沒有一個較為理想的選擇模式，主要依賴于經驗的積累。

流動相溶劑選擇的一般要求是： (1)溶劑應當是高純度，溶劑與固定相不互溶，并能保持色譜柱的穩定性；(2)溶劑的性能與使用的檢測器應當匹配；(3)溶劑對樣品應有足夠的溶解能力；(4)溶劑應具有低的粘度和適當低的沸點；(5)盡量避免使用具有顯著毒性的溶劑。在選擇流動相溶劑時，可以從影響分離度R 的因素即柱效、分離因子a和容量因子來考慮。選擇溶劑時首先應排除一些物理性質(如沸點、粘度、紫外吸收等)不適于在液相色譜中使用的溶劑，然后選擇能使分析樣品中組分的容量因子值保持在1～1O之間、洗脫強度適當的溶劑。對含多組分的樣品、值可擴展在0.5～20之間。在選出適用值的溶劑當中，還要進一步選擇能將樣品中的不同組分分離開、且能使每個相鄰組分的分離因子a大于1.05的溶劑。所選擇的適用Ic，和a的溶劑還必須與能提供高理論塔板數的色譜柱相組合。因此，作為一個色譜工作者，熟悉表征溶劑物理和化學特性的重要參數，如溶劑強度參數￡、溶解度參數δ、極性參數P、粘度η等，對液相色譜法流動相溶劑的選擇會起到十分重要的作用。
 
能夠作為液相色譜流動相使用的溶劑有100多種，但實用的溶劑只有少數幾種。在實驗室中有了甲醇、乙腈、水、四氫呋喃、正己烷、二氯甲烷，就能夠解決9O％以上的色譜分離問題。

 2、溶劑的處理和更換：液相色譜溶劑應盡量使用HPLC級溶劑。HPLC級試劑是用特殊方法生產的含有最少的微粒和最低的紫外吸收物質。水也應達到HPLC級。液相色譜實驗室應配有純水發生器。非色譜純溶劑可通過蒸餾方法進行提純，除掉大部分有紫外吸收的雜質。另外，用氧化鋁或硅膠柱可除去極性強的化合物。

理論上，完全由HPLC級溶劑組成的流動相不必過濾（但因操作過程中，因溶劑本身，容器、環境等原因，建議在進入系統使用前使用相應的濾膜進行過濾操作），其他溶劑由于含有不溶性微小顆粒，會逐漸堆積在色譜柱中堵塞流動相的通道，使柱壓力升高，柱效率下降，因此使用前一定要用0.2～0.5um 的過濾器過濾。當使用固體化學試劑(如緩沖鹽)配制流動相時過濾特別重要，不能讓固體微粒污染泵的單向閥、阻塞、損壞進樣器和柱頭過濾片。現有過濾器有水溶性和脂溶性兩種過濾膜供選擇。過濾水溶性流動相時(如甲醇／水)，先用1～2 mL甲醇潤濕過濾膜，有助于快速抽濾。

流動相在使用前必須進行脫氣處理(連同貯液器一起脫氣效果更好)， 以除去其中溶解的氣體，防止在洗脫過程中當流動相由色譜柱流至檢測器時，因壓力降低而產生氣泡。若在死體積檢測池中，存在氣泡會增加基線噪聲，嚴重時會造 成分析靈敏度下降。流動相中的氧氣對光電檢測器影響最大，使紫外檢測器基線增高，低波長檢測時信號被抵消掉。在熒光檢測中O2會使樣品的熒光淬滅，降低靈敏度，還會導致某些組分被氧化或使柱中固定相發生降解而改變柱的分離性能。常用的脫氣方法有① 氦脫氣；② 加熱回流；③ 真空脫氣；④ 超聲波脫氣。從脫氣速度和效果看，加熱回流法最好，但操作不方便，存在著火的危險。對于混合流動相不提倡用此法，因為揮發性組分會損失掉，改變流動相的組成。超聲脫氣法只能除去3O 的溶解氣體效果最差。近年來新出現的在線真空脫氣法(on—line degasser)，把真空脫氣裝置串接到貯液系統中，并結合膜過濾器，實現了流動相在進人輸液泵前的連續脫氣。其脫氣效果明顯優于上述4種方法，并適用于多元溶劑體系。

在HPLC中需要經常更換新溶劑。更換溶劑時，必須將原有的溶劑沖洗干凈。如果新舊溶劑是互溶的，則必須保證新溶劑使色譜柱重新達到平衡。否則將產生基線漂移。若新舊溶劑不互溶，則要選擇與原溶劑和新溶劑(正相和反相)都相溶的過渡溶劑沖洗，然后再用新溶劑沖洗。如異丙醇是1種很理想的過渡溶劑。特別要注意防止新舊溶劑發生反應或生成沉淀物，否則將給管路、泵及檢測器帶來污染和堵塞，給清洗工作帶來麻煩。

如果緩沖液反相流動相被正相流動相所污染，產生緩沖鹽沉淀，可用5倍柱體積的非緩沖液反相流動相沖洗系統，再用10倍柱體積的強溶劑(如乙腈)通過系統，最后用50倍柱體積的異丙醇沖洗系統，以除去所有滯留的流動相和溶劑殘留，換上反相流動相沖洗，使系統重新平衡。如果正相流動相被水溶性溶劑所污染，先用50倍柱體積的異丙醇沖洗，而后用正相流動相沖洗。在分析樣品前，最少需用10倍體積的最終流動相沖洗系統。

3、溶劑與檢測器的匹配：在使用紫外可見光檢測器時，需選用無紫外吸收特性的溶劑作流動相。樣品測定波長應當在溶劑紫外吸收波長上限以上，噪聲降至10-4 ～ 10-5AU，才能保證檢測的靈敏度，才能用于梯度洗脫。流動相溶劑在整個梯度范圍內互溶性要好，盡量減少溶劑折光指數對溶劑組成梯度的影響。溶劑折光指數的改變會導致紫外吸收度的變化，使紫外檢測器產生噪音和漂移。因此，當使用兩種或兩種以上溶劑做梯度時，其折光指數應該盡量接近，盡量減少溶劑紫外吸收度改變的影響。
 

在使用示差折光檢測器時，應使流動相的折光指數與被測樣品的折光指數有盡可能大的差別，因為二者的折射率差別越大，檢測器的響應信號越大，檢測靈敏度越高。示差折光檢測器一般不用于梯度洗脫，這是因為隨溶劑組成的改變，流動相的折光指數也在改變，無法使基線穩定。

使用熒光檢測器時，不能使用可熄滅、抑制或吸收熒光的溶劑作流動相。溶劑的極性和溶液的溫度對熒光強度有明顯的影響。增大溶劑的極性，導致熒光增強。通常熒 光物質溶液的熒光效率和熒光強隨著溫度的升高而降低。此外，當樣品濃度較高時，易引起熒光猝滅效應和內濾效應，溶液濃度越大，該效應越顯著，溶液中的其它 成分，特別是順磁性物質的存在，將使猝滅效應加劇。因此，在進行熒光檢測時，試樣要配成低于10-6 g／mL濃度的溶液，要使用不含熒光物質的溶劑。

電化學檢測器所用的流動相必須具有導電性。安培檢測器采用的流動相中必須有常用濃度范圍為0.01 mol／L-0.1 mol／L電解質(如含鹽的緩沖液)存在。流動相要有足夠高的介電常數，使電解質充分解離。流動相在電極表面呈電化學惰性，工作電壓下背景電流小。

為什么乙醇、丙醇、丙酮不被用做流動相？研究表明，當流動相的A>0.7的時候，基線噪聲會顯著增加，一般選擇的吸收值<0.5。當A>1.0時，基本就不能用使了。對于示差折光檢測器，主要考慮樣品和流動相的折光率，選用的溶劑粘度要低、沸點適中使用低粘度溶劑，可減小容質的傳質阻力，降低柱壓，利于提高柱效。從分離制備和色質連用考慮，沸點要適中，低沸點的溶劑有它的優點;但僅僅用 于分析，沸點太低，反而由于溶劑的揮發，造成保留時間的變化。盡量不用高毒性的溶劑不只是環境，單從我們自身的安全考慮，當然用低毒溶劑最好。溶劑對樣品有足夠的溶解力樣品如果不能溶解在選用的溶劑里，還怎么分析? 但如果樣品在流動相里溶劑仍然不大，可以用樣品的最佳溶劑先溶解，再用流動相稀釋，就可以了。知道了上面選擇溶劑的一般原則，就不難理解為什么不同乙醇、丙醇做流動相的原因了，因 為它們的粘度大。 還有丙酮，雖然粘度和毒性較低、溶解度大、極性適中，但用于它的截至吸收波長為330nm， 所以不常用，如果樣品的吸收大于330nm，其實用丙酮是一個不錯的選擇。
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